style="width:6.59997in;height:3.32662in" /> 本文是学习GB-T 33117-2016 小麦基腐病菌检疫鉴定方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了小麦基腐病菌的检疫鉴定方法。
本标准适用于小麦属、黑麦属等禾本科寄主中小麦基腐病菌的检疫鉴定。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样
SN/T 2589 植物病原真菌检测规范
学名：Helgardia herpotrichoides(Fron)Crous &. W.Gams 2003
异名：无性态 Cercosporella herpotrichoides Fron 1912,
Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron)Deighton 1973.,Ramulispora
herpotrichoides(Fron)Arx 1983;有性态 Tapesia yallundae
var. yallundae,Oculimacula yallundae(Wallwork &.Spooner)Crous &.W.Gams
2003。
传播途径：主要以病残体混于种子间进行远距离传播。
小麦基腐病菌的其他信息参见附录 A。
病原菌的为害症状、分离培养性状、形态特征和特异性 PCR
检测结果等是该检疫鉴定方法的主要
依据。
生物显微镜、电子天平(感量0.001
g)、离心机、普通冰箱、超低温冰箱(一80℃)、恒温水浴锅、涡旋
振荡器、恒温光照培养箱、高压灭菌器、生物安全柜、PCR
仪、电泳仪、凝胶分析成像系统、全自动 DNA
提取仪。
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T6682 中相关规定。
表面活性剂吐温-20、琼脂、青霉素、链霉素、0.5%次氯酸钠 (NaClO)。
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按照SN/T2589,
仔细检查寄主植物的茎、枝条、叶片等部位是否出现疑似症状(参见附录 A)。
对
可疑植物病残体和土壤应取样送实验室做进一步检验，取样方法和步骤按照SN/T
2122。
小麦基腐病菌主要引起鞘枯和叶枯，病斑多在地际到10 cm
之间的叶鞘和茎秆上形成椭圆形或“眼
纹"状病斑。检查种子中有无附着病残体、土壤等。
将7.1中的样品进行 PCR 初筛检测，PCR 凝胶电泳检测见附录 B。
对于阳性结果进行下一步
检测。
马铃薯蔗糖培养基(PSA)、 马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、 玉米琼脂培养基(CMA)
及选择性培养基
的制备见附录 C。
取待检的进境病原菌的寄主种子样品50 g 放入250 mL
洁净的三角瓶中，加蒸馏水100 mL, 再加
表面活性剂吐温-201滴～2滴，用铝箔纸或培养纸将三角瓶封口，将三角瓶放在往复式振荡器上，
150g 振荡洗涤5 min。 立即取下三角瓶，将洗涤悬浮液用干净纱布过滤后注入10
mL～20 mL刻度离 心管内，1000 g 离心3
min,取出离心管，倾去上清液，再加剩余洗涤悬浮液，混合离心，直至所有洗涤
悬浮液离心完毕，留沉淀物。将沉淀物从离心管中全部移入2mL 离心管中，12000
g 离心10 min,以
移液管移取上清去除水分，在常温下将沉淀风干。对样品洗涤液中收集到的沉淀物在培养基上进行分
离培养。
将变色的可疑材料，剪成约3 mm～5mm 小段，用0.5%次氯酸钠表面消毒10
min,再用灭菌水冲
洗30 min,置于玉米琼脂培养基(CMA) 平板上(配方见附录C),13℃~15℃,
近紫外光照射培养，培养
7 d~14d开始观察菌落形态和菌丝形态特征。
取 2 g 土壤放入200 mL 灭菌水中，用磁力棒搅拌30
min,使其充分混匀，悬浮液稀释10倍，取 1mL 土壤稀释液涂抹于选择性PDA
平板上(配方见附录C), 每处理5～10个重复，15℃,全光照下培
养，培养7 d～14d 开始观察菌落形态和菌丝形态特征。
7.3.2、7.3.3和7.3.4获得的菌丝，可通过以下方法获得分生孢子。水琼脂培养基(WA)
上2周龄菌
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丝，9℃,7 d~10d 产生初生孢子，由菌丝或孢子的水悬浮液置于 PDA
表面，18℃~21℃,4 d 则产生
大量分生孢子。
判定结果见附录B。
病原在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养，培养菌丝呈鹅绒状或细棉状。培养初期的整体呈凸状。
菌落圆形、光滑，边缘平坦，中央有明显的气生菌丝，菌落表面灰绿色，背面暗色，22℃生长速率平均为
1.2mm。
在玉米琼脂培养基上，菌落呈墨绿色或粉红色或淡褐色。在选择性培养基上，菌落呈茶褐色。
小麦基腐病菌有2种类型的菌丝体： 一种为营养菌丝，黄褐色，线性，有分枝；
一种暗色，厚壁，由膨
大的多角形细胞构成，常在植株体表形成类似子座的菌丝团。分生孢子梗无色，单生或罕有分枝，倒棒
状，产孢细胞全壁芽生合轴式产孢，孢痕不肥厚，不发亮，呈截断状。分生孢子无色，针状，直或略为弯
曲。分生孢子多数有3个～7个隔膜，偶见超过10个，大小(30μm～120μm)×(1μm～3.5μm)
(见附
录 D)。
子囊盘直径0.2 mm～1.5
mm,无柄，密集聚生，着生于簇生的灰褐色钩状菌丝之上，呈圆形或叶
状。子囊托灰褐色，杯状，后变为小盘状，边缘反卷，在子囊盘未成熟时常被白色透明或浅褐色的绒毛，
成熟时少见。子囊(35μm～50μm)×(4μm～7.4μm),
内含8个子囊孢子，圆桶状纺锤形或棍棒状纺
锤形，近顶点处渐缩呈短的杆状。子囊孢子(7μm～11μm)×(1.5μm～2.3μm),
透明，细的圆桶状-棒
状，棍棒状纺锤形或纺锤形，末端浑圆，直或轻微的不规则，罕见弯曲。油滴不明显，无隔膜或罕见1个
隔膜，子囊孢子在子囊内呈不规则的双行排列。侧丝丝状，长度跟子囊相近，直径2.0μm～2.5μm,
顶
端钝圆，透明，有隔膜。
以 PCR
初筛结果、病原菌培养性状、形态特征等作为鉴定依据，进行综合判定。若PCR
初筛为阳
性，且与8.2、8.3鉴定特征吻合，鉴定为小麦基腐病菌。
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出小麦基腐病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复
核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。
从检测样品中分离并鉴定为小麦基腐病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于PSA
培养基斜面上 (配方见附录 C),
存活后置于4℃~8℃黑暗条件下保存，定期(3个月)转接，以防止病菌死亡，至少保
存6个月，必要时用病菌分生孢子作冻干菌种保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。
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完整的实验记录包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和
审核人员签字。 PCR 凝胶电泳检测应有电泳结果照片。
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(资料性附录)
小麦基腐病菌其他信息
A.1 名 称
中文名：小麦基腐病菌
英文名：Eye spot of cereals
学 名 ：Helgardia herpotrichoides (Fron) Crous &. w. Gams 2003。 曾 用
学 名 ， Pseudocercosporella herpotrichoides(Fron)Deighton
1973.,该学名分类地位：无性态属于半知菌亚门
(Deuteromycotina),丝孢菌纲(Hyphomycetes), 丝孢目(Hyphomycetales),
淡色孢科(Moniliaceae),假 小尾孢属(Pseudocercosporella);有性态 Tapesia
yallundae Wallwork &.Spooner 1988,属于子囊菌亚
门(Ascomycota), 煤炙目(Capnodiales),球腔菌科(Mycosphaerellaceae),Tapesia
属。
A.2 寄主范围
小麦属 (Triticum)、 大 麦 (Hordeum vulgare)、栽培二棱大麦 (Hordeum
distichon L.)、黑麦 (Secale cereale)、燕 麦(Avena
sativa)以及山羊草属(Aegilops)、 冰草属(Agropyron)、 剪股颖属
(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)、 雀麦属(Bromus)、 鸭茅属(Dactylis)、
翠雀属(Delphinium)、 偃麦 草(Elytrigia repens)、羊茅属(Festuca)、
潜草(Koeleria cristata)、黑麦草属(Lolium)、 路边紫草
(Lithospermum ruderale)、早熟禾属(Poa)、 黑麦属(Secale)、瓶刷草(Sitanion
hystrix)。
A.3 症状描述
小麦基腐病菌主要引起鞘枯和叶枯。可危害基部叶鞘和茎秆(地际以上10 cm
的叶鞘和茎秆),减
低千粒重和减少穗粒数，也引起茎秆开裂、倒伏、白穗和分蘖死亡。开始近地面叶鞘上形成小的褐色病
斑，而后逐渐扩大，圆形至长椭圆形或不规则，大的病斑长4 cm,
轮廓不明显，边缘褐色至暗褐色，内部
灰白色至淡绿色，病斑表面常有黑色子座。病斑在叶鞘扩展的同时向内部扩散，当小麦开始拔节时，茎
秆的近地面部位可发现同样病斑，最终环绕茎秆，产生真菌性暗色中心。抽穗后期，小麦由病斑部位折
断倒伏，严重时出现大面积倒伏，通常在病斑部的秆内侧中空处可见到集结成灰白或灰绿色棉絮状的菌
丝体。椭圆形或"眼纹"状病斑及抽穗后小麦在近地际处折断倒伏是本病最主要特征，具有诊断意义。
A.4 分 布
欧洲：奥地利、白俄罗斯、俄罗斯、比利时、波兰、丹麦、德国、法国、芬兰、荷兰、捷克、挪威、瑞典、瑞
士、土耳其、西班牙、匈牙利、意大利、英国、爱尔兰、保加利亚、拉脱维亚、立陶宛、罗马尼亚、乌克兰、希
腊、塞尔维亚和黑山。
美洲：美国、加拿大。
非洲：摩洛哥、南非、突尼斯。
亚洲：日本、马来西亚。
大洋洲：澳大利亚、新西兰。
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A.5 生物学特性和传播方式
本菌喜低温，0℃即可产孢，5℃~15℃为产孢适温，低于0℃或高于20℃都不产孢。冬小麦秋苗 期至春季都可发生侵染。病原菌由胚芽鞘或植株近地面叶鞘直接穿透侵入或由气孔侵入。饱和湿度
下，6℃~15℃时，在15 min 内即可侵入，4周后发病。菌丝体也可直接侵染寄主。
病残体上产生的分生孢子和菌丝是主要的初侵染源，并可在其上存活数年。病残体上的分生孢子
主要靠风雨传播扩散到新枝，或通过嫩枝上菌丝生长向植株扩散。此病可通过种子间混杂的病残体及
土壤带菌传播。
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(规范性附录)
普通 PCR 检测方法
B.1 寄主植物 DNA 的提取
将有疑似症状的样品或随机抽取的样品采用植物 DNA 提取试剂盒对样品进行DNA
提取。
B.2 引物序列
正向引物 Ty16F:5'-GCGCTGGAAAAAGAGGACTG-3';
反向引物 Ty16R:5'-TGGAAGGGTCTTGCAGGG-3';
扩增片段大小为1.05 kb。
B.3 PCR 反应体系及参数
B.3.1 PCR 反应体系
PCR 反应体系见表 B.1。
表 B.1 PCR 反应体系
|
|
|---|---|
|
|
|
2.5 mmol/L |
|
0.2 mmol/L |
|
0.2 μmol/L |
|
0.2 μmol/L |
|
2.5 U |
|
0.5 ng/μL |
|
50 μL |
B.3.2 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置
B.3.2.1 阴性对照：以待测健康的植株组织洗涤液中提取的 DNA 为模板。
B.3.2.2 阳性对照：采用小麦基腐病菌或含有待测基因序列的质粒。
B.3.2.3 空白对照：设两个： 一是提取DNA 时设置的提取空白对照(以H₂O
代替样品);二是 PCR 反
应的空白对照(以水代替 DNA 模板)。
B.3.3 PCR 反应参数
94 ℃/2 min;94℃/60 s,60℃/30 s,72℃/3min,35个循环；72℃/4 min。
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B.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测
制备1%的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR 扩增产物，用 DNA
Marker 作为分子
量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性
DNA
条带，并拍摄记录。
B.4 结果判断
阴性对照和空白对照在1.05 kb 处未出现扩增条带，待测样品与阳性对照在1.05
kb 处出现扩增条
带，判定结果为阳性。
阴性对照和空白对照在1.05 kb 处未出现扩增条带，阳性对照在1.05 kb
处出现扩增条带，且样品
无特异性扩增，判定结果为阴性。
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(规范性附录)
培养基的制备
C.1 马铃薯蔗糖培养基(PSA)
马铃薯去皮后洗净，切成小块，称取200 g,蒸馏水中煮30 min,
用4层纱布过滤，加入10 g～20 g 蔗糖、17g～20g
琼脂，加热使之完全溶解，蒸馏水定容至1000mL,121℃ 高压灭菌15 min。
为抑制细
菌生长，可在培养基中适当添加青霉素和链霉素。
C.2 马铃薯葡萄糖培养基(PDA) 及选择性培养基
马铃薯去皮后洗净，切成小块，称取200 g,蒸馏水中煮30 min,
用4层纱布过滤，加入10 g～20 g
葡萄糖、17 g～20g 琼脂，加热使之完全溶解，蒸馏水定容至1000 mL,121℃
高压灭菌15 min。
在以上培养基中加入硫酸链霉素300 mg/L, 硫酸铜800 mg/L～1000
mg/L,可作为选择性培养基
用以分离土壤中的小麦基腐病菌。
C.3 玉米琼脂培养基(CMA)
量取500 mL 蒸馏水，加热至70℃,加入200 g 玉米，保持温度在60℃左右约1
h,用纱布过滤后， 加入适量的蒸馏水补足500 mL。 另取500 mL
蒸馏水，加入15.0 g～20.0g 琼脂粉，加热使之慢慢融
化，过滤后补足水至500 mL。 两液混合后分装，121℃灭菌20 min。
或将60 g 玉米粉加入蒸馏水中，搅匀，文火煮沸1h,纱布过滤，加入15.0
g～20.0g 琼脂粉，加热使
之慢慢融化，补足水量至1000 mL, 分装，121℃灭菌20 min。
GB/T 33117—2016
(规范性附录)
小麦基腐病菌症状及形态特征图
小麦基腐病菌症状及形态特征图见图 D.1～ 图 D.4。
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注：引自 Peter Scott。
注：引自 Peter Scott。
a) 小麦 b) 大麦
图 D.1 小麦基腐病菌发病症状
style="width:6.34667in;height:4.21344in" />
图 D.2 小麦基腐病菌分生孢子
style="width:1.48786in" />GB/T 33117—2016
注：引自 Wallwork.H.。
style="width:5.43544in;height:4.84586in" />
图 D.3 小麦基腐病菌子囊和侧丝
style="width:4.52969in;height:4.25854in" />
20μm
注：引自 Wallwork.H.。
图 D.4 小麦基腐病菌子囊孢子
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